-

Gir Brasil em parceria com criador José Mauricio disponibiliza prenhez sexada de femea da matriz Jamantha do Mago, Girolando 3/4 de Holandes que produziu 123Kg de leite em 3 ordenhas dia, opção de acasalamento com Teatro da Silvania e Touchdown.

O requerimento de nutrientes varia com o estágio de lactação e gestação. A Figura 1 ilustra a forma e a relação da curva de produção de leite, consumo de matéria seca e variação na condição corporal durante a lactação. Assim, cinco distintas fases alimentares podem ser definidas para obter ótima produção, reprodução e saúde de vacas leiteiras, como veremos neste artigo de hoje:

Figura 1. Fases do ciclo reprodutrivo de uma vaca leiteira

1. Início de lactação – 0 a 70 dias, pico de produção de leite.

2. Pico de consumo de alimento – 79 a 140 dias, declínio da produção de leite.

3. Metade e final da lactação – 140 a 305 dias, declínio da produção de leite, gestação

4. Período seco – 60, em alguns casos 40 a 14 dias antes da próxima lactação, gestação

5. Transição e período pré-parto – 14 dias até a parição.

Fase 1 – Início da lactação

A produção de leite aumenta rapidamente durante esse período, atingindo seu pico entre 6 a 8 semanas após o parto. O consumo de alimento não acompanha o ritmo do requerimento de nutrientes para a produção de leite., especialmente para energia. Então, tecidos corpóreos são mobilizados suprir o requerimento de energia para a produção de leite, e a vaca emagrece. Assim, ajustar a vaca para a ração de início de lactação é um importante manejo prático durante essa fase. Aumentar a quantidade de grãos (energia) em cerca de 0,5 kg dia, por exemplo, aumenta a ingestão de nutrientes e minimiza problemas de acidose. Mas, quantidade excessiva de grãos, acima de 60% da matéria seca total, podem causar acidose e baixa gordura do leite. O nível de fibra na ração total nunca poderá ser menor do que 18% de FDA e 28% de FDN.

As forragens devem participar em pelo menos 21% das unidades de FDN ou aproximadamente 75% do total de FDN da ração total. A forma física da figra é também importante. Ruminação e digestão normal podem ser mantidas se pelo menos 20% das forragens tiverem tamanho de partícula de pelo menos 5 centímetros.

Proteína é um nutriente crítico durante o início da lactação, pois o seu fornecimento adequado ou excedendo o seu requerimento, ajuda a estimular o consumo de alimento e permite o uso eficiente dos tecidos corporais mobilizados para a produção de leite. Em alguns casos, as rações podem chegar a requerer 19% de proteína bruta para suportar altos níveis de produção. O tipo de proteína (degradável ou não degradável), e a quantidade, vão depender dos ingredientes da ração, do método de alimentação, e do potencial da vaca para produzir leite.

Baixa produção de leite no pico de lactação e problemas de cetose ocorrem quando os níveis de nutrientes não são alcançados. Baixo pico de lactação significa baixa produção de leite na lactação, pois para cada menos 0,5kg de leite no pico de lactação equivale a menos 110 litros de leite na lactação. A solução para evitar esse problema é forçar a vaca a aumentar o consumo de alimento, manejando-a da seguinte maneira:

- Fornecer forragem de alta qualidade

- Estar seguro de que a ração contém adequada quantidade de PB, PDR e PNDR

- Aumentar a quantidade de energia em taxas constantes após a parição

- Considerar a adição de gordura à dieta

- Permitir constante acesso ao alimento

- Minimizar ao máximo as condições de estresse

Fase 2 – Pico do consumo de alimento

As vacas devem ser mantidas no pico de lactação pelo maior tempo possível. Nesta fase, o consumo de alimento estará perto do máximo e irá suprir a demanda por nutrientes. Nesta fase as vacas devem deixar de perder peso e manter ou ganhar pequenas quantidades diárias. Nesta fase, a ração não precisa conter mais do que 40% de carboidratos não fibrosos. A qualidade da forragem ainda deverá ser alta, a fim de manter função ruminal e gordura do leite.

Problemas potenciais durante esse período inclui uma rápida queda na produção de leite, baixo teor de gordura do leite e cetose. Para maximizar o consumo de alimento, deve-se:

- Fornecer alimentos várias vezes ao dia

- Fornecer alimentos de alta qualidade

- Limitar a quantidade de uréia, talvez em 100 gramas por dia

- Minimizar as condições que causam estresse

Fase 3 – metade e final da lactação, gestação

Esta fase poderá ser fácil para manejar. A produção de leite estará declinando, a vaca estará gestante, e o consumo de nutrientes facilmente providos ou excedendo os requerimentos. A quantidade de energia poderá diminuir, pois nesta fase as vacas requerem menos quantidade de alimento para repor as reservas corporais do que vacas secas. Vacas jovens, principalmente as de primeira cria, deverão receber aproximadamente 20% a mais de nutrientes. Nesta fase, podemos aumentar a quantidade de uréia na dieta dos animais. Os problemas potenciais nesta fase são poucos, salvo o fato de que as vacas podem declinar de 8 a 10% na produção de leite por mês.

Fase 4 – Período seco – 60 a 14 dias antes do parto

Esta fase é crítica para o ciclo de lactação da vaca. Um bom programa de manejo de vacas secas pode aumentar a produção de leite durante a próxima lactação, e minimizar os problemas metabólicos imediatamente após a parição.

Logicamente, um programa de alimentação para a vaca seca em separado das vacas em lactação é requerido. A dieta deverá ser formulada especialmente para atender aos requerimentos das vacas secas: mantença, crescimento fetal e reposição das reservas corporais. Um mínimo de 12% de PB na ração é recomendado para essa fase. O consumo de matéria seca poderá ser próximo de 2% do peso vivo. O consumo de forragem deverá ser no mínimo 1% do peso vivo ou 50% da MS da ração total. A alimentação com grãos deverá ser de acordo com a necessidade e não exceder 1% do peso vivo. Dependendo da condição corporal, deve-se restringir a quantidade de alimento para evitar que cheguem obesas ao parto. Suprimento de cálcio e fósforo é necessário, mas deve ser evitado grandes excessos. Normalmente, o cálcio é requerido entre 60 e 80 gramas e o fósforo entre 30 e 40 gramas diárias. Também, adequado suprimento de vitaminas A, D e E ajudam na sobrevivência da cria, evita retenção de placenta e febre do leite. Minerais traços, a exemplo de selênio e outros, devem ser adequadamente suplementados.

Problemas tais como febre do leite, deslocamento de abomaso, retenção de placenta, síndrome do fígado gorduroso, falta de apetite, juntamente com outras desordens e doenças, são comum em vacas excessivamente gordas. Um bom manejo nesta fase inclui:

- Observar a condição corporal e ajustar o fornecimento de energia se necessário

- Fornecer somente os nutrientes requeridos e evitar grandes excessos

- Começar a dieta de transição duas semanas antes da previsão de parto

- Evitar excesso no consumo de cálcio e fósforo e de potássio

Fase 5 – período de transição

Essa fase é bastante delicada e muito importante para ajustar a vaca seca ao parto, à ração de lactação e prevenir problemas metabólicos. Alguns grãos, não previamente fornecidos, poderão ser incluídos progressivamente nas dietas, duas semanas antes do parto previsto, visando começar a modificar a flora ruminal de uma população adaptada a uma dieta de alta forragem para uma população mista capaz de fermentar forragem e alta quantidade de concentrado. Algumas estratégias de manejo nesta fase incluem:

- fornecer grãos para adaptar o microbiota ruminal e estimular a formação das

papilas ruminais responsáveis pela absorção

- Aumentar a quantidade de proteína na dieta

- Limitar ou retirar a gordura da dieta, pois pode reduzir o consumo

- Lançar mão de niacina ou sais aniônicos para ajudar a prevenir cetose e febre do leite.

Considerações finais

Manejar vacas leiteiras não é tarefa fácil. Entretanto, uma vez observada as particularidades de cada fase do ciclo lactacional, fica mais fácil entender e superar as dificuldades de cada etapa. Ressalto novamente a importância das fases período seco e início da lactação, pois a grosso modo, são essas duas fases que determinam se o produtor terá o não resultado no balde.

Fonte: http://www.milkpoint.com.br/?noticiaID=60707&actA=7&areaID=61&secaoID=176

A origem do primeiro Girolando não dista muito do tempo.
As primeiras notícias do surgimento desses animais data-se da década de 40.

Pelos anseios dos criadores brasileiros, começou a ser praticado o cruzamento do Gir com o Holandês intensamente, procurando que as duas raças se complementassem com rusticidade e produtividade.

A multiplicação desses animais, mesmo desordenadamente, foi acelerada (pela alta produtividade e eficiência reprodutiva). Atualmente encontramos o Girolando em todos os Estados da Federação.

Certificando-se disso, em 1989 o Ministério da Agricultura, juntamente com as Associações representativas traçaram as normas para formação do Girolando – Gado Leiteiro Tropical (5/8 Hol + 3/8 Gir – Bi Mestiço), transformando-o em prioridade nacional.

E a Associação Brasileira dos Criadores de Girolando, por sua estrutura física e administrativa, e pelo trabalho sério e eficaz durante os dez anos de Procruza, foi dignificada para comandar e executar as normas para formação da raça Bovina Girolando.

Contamos com o apoio de 26 associações subdelegadas e escritórios conveniados em vários estados brasileiros.

VIGOR HÍBRIDO:
UM DOS MAIORES ATRIBUTOS DO GIROLANDO

A utilização de Heretose é a mais útil e extensiva aplicação da moderna genética. Processo de resposta rápida, sendo ainda o método que pode utilizar mais intensamente as qualidades existentes nas raças puras.

Geralmente, o nível de resposta do vigor híbrido é maior para os caracteres de baixa herdabilidade, e que por sua vez possuem maior valor econômico.

Dádiva da natureza, pois tal é a superioridade do Girolando, que além de ter conjugado a rusticidade do Gir e a produção do Holandês, adicionou características desejáveis das duas raças em um único tipo animal, fenotipicamente soberano, com qualidades imprescindíveis para produção leiteira nos trópicos.

A FORMAÇÃO DA RAÇA:

Modernamente não se cogita de fazer comparações entre raças com espírito competitivo, mas trabalhar de maneira a buscar as qualidades que cada uma possa oferecer, em diferentes ambientes, para que se complementem com mais eficácia econômica.

A raça, fundamentalmente produto do cruzamento do Holandês com o Gir, passando por variados graus de sangue, direciona-se visando a fixação do padrão racial, no grau de 5/8 Hol + 3/8 Gir, objetivando um gado produtivo e padronizado.

ESTRATÉGIA DE CRUZAMENTO – GIROLANDO

Fonte: http://www.girolando.com.br/site/ogirolando/generalidades.php

ANIMAIS SÃO CRIADOS A PASTO PARA REPRODUZIR AS CONDIÇÕES REAIS EM CADA PROPRIEDADE
Até meados da década de 1990 o gir leiteiro sofria com uma série de entraves. De um lado, o criador enfrentava a concorrência dos criadores de gir para a produção de carne, até hoje reticentes à disseminação de animais para leite. Do outro, a implacável comparação com o gado holandês, extremamente produtivo, porém pouco adaptado ao clima brasileiro.
Em 1993, quando a Embrapa Gado de Leite concluiu um trabalho iniciado em 1985. No estudo, animais gir leiteiro foram profundamente avaliados e com os dados em mãos tornou-se possível comparar com outras raças. Diante dos números veio a confirmação: “Ali ficou provado que o gir leiteiro é capaz de gerar animais extremamente produtivos em relação à média brasileira e, acima de tudo, adaptados ao clima e às condições brasileiras”, explica o consultor Luiz Ronaldo de Oliveira. Pela primeira vez  se teve resultados de touros provados, capazes de passar adiante uma série de características importantes de mneira direcionada nos acasalamentos. Entre elas, capacidade digestiva, formato dos úberes, fertilidade, habilidade materna, entre outros.

Rusticidade, Longevidade e Fertilidade a Pasto – Selecionado no Brasil e perfeitamente adaptado à ecologia tropical com extrema capacidade de auto-regulação do calor corporal, sua conformação muscular e esquelética, aprumos e pés fortes, hábito de pastejo, capacidade ruminal etc., são condições que lhe conferem grande resistência e adequação ao meio ambiente. Longevidade, fecundidade e precocidade são características evidentes Gir, virtudes nescessarimente aquiridas na evolução da raça em sua origem no sub continente Indiano, resultando ótima produção vitalícia e uma prole numerosa, que se inicia, normalmente, entre os 30 e 36 meses de idade (idade à 1ª cria), sendo que o pico de produção leiteira chega até os 10 anos, mantendo o mesmo nível, satisfatoriamente, até aos 15 anos de idade, evitando assim o descarte prematuro de matrizes e reprodutores, possibilitando ao criador um melhor ganho com a venda de animais e baixo índice de descarte ao ano.
A eficiência reprodutiva e produtiva do Gir é seu ponto forte (período de serviço curto, intervalo entre partos ideal e maior número de partos por vaca, aproveitamento do bezerro macho, bom desenvolvimento dos machos com boa qualidade de carcaça), tendo em vista que animal é tolerante ao clima e parasitos tropicais. A conformação anatômica do aparelho reprodutivo das matrizes Gir vem sendo ano pós ano melhoradas com a utilização de touros provados, corrigindo até os problemas que são notados em outras raças. Tanto novilhas como vacas, não apresentam problemas de parto. Essa constituição física garante, também, pleno sucesso com relação aos programas de Inseminação Artificial e Transferência de Embriões. Nos machos Gir, a temperatura do corpo está intimamente relacionada com a regulação da temperatura da bolsa escrotal (descida e subida) proporcionando, assim, uma maior produção de espermatozóides viáveis.
Na utilização do Gir em cruzamento com o Holandês, produz o Girolando, responsavél por 85 % do leite produzido no Brasil, é evidente a afinidade com o tipo de exploração, propriedades, mercado e o produtor nacional. Como o sistema de produção de leite é altamente influenciado por fatores “Extra Genéticos”, a prioridade dos produtores profissionais deve se fundamentar nos elementos reais de produtividade, ou seja, reduzir ao máximo o custo de produção e não aumentar o volume produzido a qualquer custo.
No Brasil, esse equacionamento só é possível com a utilização de raças que produzam em condições bastante satisfatórias sob partejo e consigam aproveitar muito bem as forragens de baixa qualidade.

Animais nascidos atravez da fertilização em vitro na fazenda Santo Antônio do Bom Café, integrante da parceria agricola Brasil.

Há mais de um século, foi observada pela primeira vez, a fecundação de um óvulo de estrela do mar com a posterior formação da primeira célula do futuro embrião. Os invertebrados marinhos foram objeto das primeiras pesquisas porque, ao contrário dos mamíferos, a fecundação ocorre externamente ao sistema reprodutor da fêmea. Nos mamíferos, ainda no final do século XIX, surgiu o primeiro relato sobre a possibilidade de se cultivar embriões in vitro. Cientistas interessados no estudo de aspectos relacionados à reprodução e ao desenvolvimento de organismos superiores iniciaram os primeiros ensaios com a finalidade de estabelecer metodologias que permitissem a manipulação de embriões.

Os primeiros trabalhos experimentais em embriologia de mamíferos foram realizados com coelhos, tendo em vista suas características biológicas favoráveis, como o tamanho relativamente grande do óvulo, o que facilita a manipulação, e a ovulação induzida pelo acasalamento, fato de elevada conveniência para determinação precisa da idade dos embriões. Alguns desses trabalhos iniciais incluem uma descrição acurada dos estágios embrionários pré-implantacionais, que foram descritos em 1875 por Van Beneden, transferência de embriões para o oviduto, descritos em 1890 por Heape, realização de um filme das sucessivas clivagens de uma mórula em cultura realizado por Lewis e Gregory em 1929, entre outras observações. Porém, as dificuldades relativas à compreensão das necessidades nutricionais e, as limitações impostas pelas características físico-químicas dos meios utilizados consistiam em barreiras técnicas a serem rompidas.

Somente no inicio do século XX, juntamente com o desenvolvimento da química, que permitiu a produção de meios de melhor qualidade, a embriologia passou por progressos significativos, com profundos reflexos no sucesso de coleta e cultivo de embriões. Finalmente, na década de 50, Wesley Whitten propôs uma nova formulação para os meios de cultura, que passaria a ser utilizada tanto na coleta quanto no cultivo dos embriões, ampliando significativamente o número de embriões implantados com sucesso. Whitten desenvolveu um meio utilizando uma solução de Krebs-Ringer bicarbonato, suplementada com albumina sérica bovina, o qual foi capaz de promover as clivagens de um embrião de camundongo com uma célula até o estádio de blastocisto. Juntamente com Whitten, Ralph Brinster iniciou uma linha de pesquisa para determinar quais as necessidades nutricionais de um embrião em cultura e, durante o processo, desenvolveu a técnica da cultura de embriões em microgotas utilizada atualmente em vários laboratórios no mundo, tanto na área animal, quanto humana.

Essas novas condições de cultura, apesar de muito simples, permitiram a expansão do desenvolvimento das técnicas de produção de embriões in vitro. Marco na história da FIV, Chang (1959) relatou o nascimento do primeiro mamífero (coelho) gerado a partir dessa técnica. A partir daí, até o final dos anos 70, vários outros relatos da obtenção de FIV seguida de nascimentos de filhotes saudáveis foram registrados. Após o relato de Chang (1959), Whittingham, em 1968, obteve sucesso trabalhando com camundongos e, alguns anos mais tarde Toyoda e Chang estabeleceram a FIV para ratos. Steptoe e Edwards (1978) estabeleceram um novo marco na história da FIV no mundo, com o sucesso do nascimento do primeiro bebê humano.

No que concerne aos animais de produção, apenas na década de 70 é que surgiram os primeiros relatos de sucesso no nascimento de filhotes após maturação in vitro, seguida de transferência para fertilização dos embriões in vivo. Em 1971, Crosby e sua equipe produziram filhotes saudáveis de ovelhas, no mesmo ano Leman e Dziuk obtiveram sucesso trabalhando com porcos, resultado que foi comprovado em 1974 por Motlik e Fulka. O primeiro relato da produção de um bezerro utilizando a técnica descrita acima ocorreu em 1970, e foi realizado por Sreenan e sua equipe.

Até esse momento, aparentemente, não havia nenhum relato da produção de filhotes bovinos nascidos após FIV. Apesar das técnicas de transferência de embriões produzidos in vivo em bovinos estarem sendo amplamente utilizadas nos anos 70, os esforços para a produção de embriões in vitro em bovinos foram considerados por Blandau (1980) como um “total fracasso”. Entretanto, mesmo com as evidências apresentadas por Blandau (1980) no início da década de 80 finalmente foi produzido um bezerro a partir de FIV. Brackett et al. (1982) foram os primeiros a publicarem o nascimento de um bezerro sadio, ocorrido no dia 9 de junho de 1981, produzido por FIV. Em seu trabalho foram utilizadas 22 doadoras e 7 receptoras, para a fertilização foi utilizado tanto sêmen a fresco quanto amostras congeladas. As amostras de sêmen eram de animais pré-selecionados para inseminação artificial, o que indicava uma boa qualidade seminal. A coleta dos oócitos foi realizada via cirúrgica, e foram recuperados 177 oócitos, dos quais 52% fertilizaram. Apesar da grande quantidade de embriões produzidos para transferência, a gestação só foi obtida em uma doadora, a qual recebeu apenas um embrião no estágio de 4 células. O primeiro bezerro de FIV nasceu pesando 45kg e, após alguns meses de observações, não foram visualizadas alterações no desenvolvimento e no comportamento do animal.

A partir de então, a PIV de bovinos recebeu grande impulso por ter sido verificado que poderia ser integralmente viabilizada sob condições artificiais. Por todo o potencial de aplicação que a PIV representa para as espécies humana e animal, como pela sua expressividade tanto para a ciência básica quanto para a aplicada, tem sido muito difundida e utilizada em diversos países, inclusive de forma destacada no Brasil, a partir da década de 90. Atualmente o Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo, com cerca de 196 milhões de animais, e apresenta-se em posição de destaque na produção mundial de embriões, particularmente pela expansão no uso da fertilização in vitro em bovinos.

Bibliografia consultada:

Alvarenga, M.A. Editorial. O embrião: Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões, Jaboticabal, . Editorial, n. 22, p. 1, 2005.

Blandau, R.J. In vitro fertilization and embryo transfer. Fertility and Sterility, v.33, p.3-11, 1980.

Brackett, B.G.; Bousquet, D.; Boice, M.L.; Donawick, W.J.; Evans, J.F.; Dressel, M.A. Normal development following in vitro fertilization in the cow. Biology of Reproduction, v.27, p.147-158, 1982.

Chang, M.C. Fertilization of rabbit ova in vitro. Nature, v.184, p.466-467, 1959.

Gonçalves, P.B.D.; Visitin, J.A.; Oliveira, M.A.L.; Montagner, M.M.; Costa, L.F.S. Produção in vitro de embriões. In: Gonçalves, P.B.D.; Figueiredo, J.R.; Feritas, V.J.F. (Eds.). Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Varela, 2002. p.195-196.

Graziano, X. Olho no boi. O Estado de São Paulo, São Paulo, 10 mai. 2005. Espaço Aberto, v.126, n.40747, p.A2, 2005.

Hogan, B.; Constantini, F.; Lacy, E. Developmental genetics and embryology of the mouse: past, present, and future. In: Hogan, B.; Constantini, F.; Lacy, E. (Eds.). Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, 1986. p.12-14.

Iritani, A.; Niwa, K. Capacitation of bull spermatozoa and fertilization in vitro of cattle follicular oocytes matured in culture. Journal of Reproduction and Fertility, v.50, p.119-121, 1977.

Passos, L.A.C.; Guaraldo, A.M.A.; Alves, D.P.; Pires, L.A.; Santana, T.M.; Dini, T.H.C. Criopreservação de embriões murinos em biotérios. In: Andrade, A.; Pinto, S.C.; Oliveira, R.S. (Eds.). Animais de Laboratório criação e experimentação. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2002. p.225-245.

Steptoe, P.C.; Edwards, R.G. Birth after the preimplantation of a human embryo. Lancet, v.2, p.366, 1978.

Uma maneira de solucionar problemas relacionados com o armazenamento de ovócitos e embriões produzidos in vivo ou in vitro não transferidos é a utilização de técnicas de criopreservação. Com o advento da produção in vitro de embriões, e por estes serem mais sensíveis às crioinjúrias, muitos esforços têm sido empregados no sentido de se aprimorar o armazenamento dos mesmos. Por isso, um dos grandes desafios para a criobiologia reprodutiva tem sido desenvolver um método eficiente de criopreservação de ovócitos e embriões.

É necessário que sejam desenvolvidos protocolos específicos que resultem em boa preservação, os quais possam minimizar os danos ultra-estruturais causados às células em decorrência do processo de criopreservação e, conseqüentemente, maximizar a sua viabilidade após a descongelação. Apesar de muitos embriões parecerem viáveis após a criopreservação e remoção do crioprotetor, com a maioria de suas células intactas, os índices de gestação obtidos após as transferências são consideravelmente menores que aqueles obtidos com a transferência de embriões transferidos a fresco.

Várias técnicas têm sido testadas utilizando-se ovócitos em diferentes estágios de maturação, diferentes tipos e concentrações de crioprotetores, temperatura de exposição aos crioprotetores, curvas de resfriamento, estabilizadores do citoesqueleto e protocolos de descongelação e remoção dos crioprotetores.

REVISÃO DA LITERATURA

1. AGENTES CRIOPROTETORES E PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO

A criopreservação visa manter o metabolismo celular em estado de quiescência, tornando possível a conservação de células e tecidos por tempo indeterminado. O primeiro sucesso desta técnica foi mencionado por Whittingham (1971), utilizando embriões de camundongos.

Um dos mais importantes princípios da criopreservação reside na necessidade de se remover o máximo possível de água das células antes de se proceder a sua congelação. Se esta desidratação não ocorrer, grandes cristais de gelo se formam lesando severamente a estrutura intracelular. No entanto, a remoção demasiada de água das células também pode ser deletéria (Seidel Jr., 1986).

Independentemente da técnica, todos os métodos de criopreservação necessitam de crioprotetores, os quais são divididos em duas categorias: intracelulares (como dimetilsulfóxido ? DMSO, propanodiol, glicerol, etilenoglicol, etc) e extracelulares (como trealose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona ? PVP, etc) (Niemann, 1991). Essas duas classes de crioprotetores são usadas separadamente ou associadas para diferentes tipos de protocolo de criopreservação (Im et al., 1997; Young et al., 1998).

Seidel Jr. (1986) considera que o mecanismo de ação dos crioprotetores baseia-se principalmente na promoção do abaixamento do ponto de solidificação da solução na congelação. Isto é benéfico por várias razões, mas principalmente porque promove um maior tempo para a desidratação da célula, diminuindo a formação de cristais de gelo intracelulares. Uma segunda função dos crioprotetores parece ser sua interação com a membrana celular, exercendo uma ação estabilizadora durante as mudanças de um estado relativamente líquido para um estado sólido e, talvez até mais importante, na volta para o estado líquido na descongelação.

O etilenoglicol (EG) tem sido utilizado em diversos protocolos para a criopreservação de ovócitos e embriões em várias espécies, devido principalmente ao seu baixo peso molecular quando comparado a outros crioprotetores, proporcionando rápida entrada e saída na célula durante o período de equilíbrio e rehidratação, respectivamente, o que permite a rehidratação direta após a descongelação (Voelkel e Hu, 1992). O EG possui ainda a vantagem de ser menos tóxico do que outros crioprotetores (Cetin e Bastan, 2006).

Apesar dos efeitos benéficos do crioprotetor, não existe uma técnica de criopreservação celular que permita 100% de sobrevivência após a congelação e descongelação, mesmo utilizando-se curvas de resfriamento e aquecimento consideradas ótimas. Existem duas razões para justificar as falhas na ação dos crioprotetores: primeira, a toxicidade do crioprotetor limita a concentração em que este pode ser utilizado antes do resfriamento e, portanto, limita a eficácia da ação crioprotetora (Fahy, 1986). Segunda, os agentes crioprotetores podem ter uma ação direta na produção de crioinjúrias, como, por exemplo, alterando a polaridade do meio extracelular lesando as membranas (Arnold et al., 1983). George et al. (1995) relatam que a adição de 20% de soro fetal bovino (SFB) ao meio de criopreservação de ovócitos de camundongos previne o endurecimento da membrana pelúcida, minimizando os efeitos tóxicos dos crioprotetores.

2. INFLUÊNCIA DO ESTÁGIO DE MATURAÇÃO NA CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS

Quanto maior o volume do ovócito, maior o tempo necessário para que a célula atinja o equilíbrio osmótico em presença de crioprotetores. Isto explica o motivo da criopreservação de ovócitos bovinos ser difícil de ser realizada com sucesso e resultar em baixas taxas de produção de blastocistos após o aquecimento, FIV e cultura in vitro, pois devido ao seu grande tamanho é mais difícil para a água e os crioprotetores se moverem através da membrana plasmática (Seidel Jr., 2006). O resfriamento pode também resultar em diminuição dos índices de fertilização causada pela exocitose prematura dos grânulos corticais e o endurecimento da zona pelúcida (Fukui et al., 1995).

Os ovócitos respondem à criopreservação diferentemente dependendo do estágio de maturação nuclear. Ovócitos em estágio de vesícula germintativa parecem ser mais sensíveis à criopreservação do que ovócitos em metáfase II. A razão para a maior sensibilidade natural dos ovócitos bovinos imaturos para a criopreservação é desconhecida (Men et al., 2002; Diez et al., 2005).

Em adição aos efeitos negativos, os processos bioquímicos no interior dos ovócitos também podem ser afetados pela criopreservação, assim influenciando negativamente a maturação citoplasmática (Men et al., 2002). Sugere-se também que os processos de congelação e descongelação podem alterar as propriedades físico-químicas dos lipídeos intracelulares. Os lipídeos intracelulares são fonte de energia para o ovócito e constituem material para a membrana citoplasmática do futuro embrião (Didion et al., 1990).

3. USO DE ESTABILIZADORES CITOESQUELÉTICOS DURANTE A CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS E EMBRIÕES

Tanto as baixas temperaturas a que são submetidos os ovócitos, como a adição de substâncias crioprotetoras modificam a organização dos microfilamentos de actina, e assim, alterações irreversíveis de outros componentes celulares podem ocorrer como a liberação precoce das enzimas dos grânulos corticais, previnindo completamente a fertilização ou incompletamente o bloqueio à polispermia, ambos levando à diminuição nas taxas de clivagem após a inseminação (Albarracín et al., 2005).

Isachenko et al. (1998) utilizaram a citocalasina-B para estabilizar componentes citoesqueléticos, tornando-os mais flexíveis e menos susceptíveis à injúrias durante o estresse osmótico da congelação de ovócitos de porcas, demonstrando o efeito reversível da droga. O tratamento das células com citocalasina-B faz com que a membrana plasmática se torne menos rígida e mais elástica e, assim, os microfilamentos não se rompem durante manipulações prolongadas.

4. CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÓCITOS E EMBRIÕES

A partir desses conceitos preliminares de criopreservação, duas técnicas podem ser opções viáveis para a preservação de ovócitos e embriões: o método tradicional de congelação lenta e a vitrificação (Hochi et al., 1996).

As substâncias crioprotetoras vêm sendo utilizadas em diversas concentrações e combinações. Tais substâncias são adicionadas às soluções em um único passo ou paulatinamente e os ovócitos e embriões criopreservados com diferentes curvas de abaixamento da temperatura, sendo em alguns casos mergulhados diretamente no nitrogênio líquido a partir da temperatura ambiente. Da mesma maneira, a temperatura de aquecimento tem variado de 20 a 37°C em banho-Maria ou ao ar e a retirada do crioprotetor realizada em um ou mais passos (Landim-Alvarenga, 1995).

4.1. Congelação

Com relação aos avanços obtidos na criobiologia nos últimos anos, muito poucos protocolos de congelação de ovócitos e embriões têm sido colocados na prática. Na maioria das vezes é utilizado o método tradicional de congelação (Palasz e Mapletoft, 1996).

Denominou-se curva clássica de congelação os procedimentos descritos por Whittinghan (1980) para conservação de embriões mamíferos em baixas temperaturas: 1) equilíbrio no crioprotetor; 2) envase; 3) colocação das palhetas no aparelho congelador; 4) ?seeding?; 5) resfriamento de -0,3 a -0,5°C por minuto até -32°C; 6) imersão e conservação no nitrogênio líquido; 7) descongelação; remoção do crioprotetor.

Os procedimentos adotados por Niemann (1991) para congelação de embriões bovinos foram: 1) adição de 1,4M glicerol feita em única etapa à temperatura ambiente, com período de equilíbrio de 20 minutos; 2) envase dos embriões em palhetas de 0,25mL, com três colunas de meio, separadas por duas colunas de ar, permanecendo o embrião na coluna central; 3) transferência das amostras para o banho de álcool, à temperatura de -7ºC, realizando-se o ?seeding?; 4) após 5 minutos da indução da cristalização, a temperatura foi decrescida à 0,3°C por minuto, até atingir -28°C; 5) de -28°C à -35°C, a taxa de resfriamento foi de -0,1°C por minuto, sendo as palhetas mergulhadas em nitrogênio líquido.

Porém, Schneider e Mazur (1984) demonstraram uma adequada curva de resfriamento no processo de congelação de embriões bovinos que propicia uma eficiente remoção da água intracelular, assim descrita: 1) após a adição do crioprotetor e envase, as amostras devem ser transferidas para o recipiente do congelador previamente resfriado à temperatura próxima de -5°C para soluções a 1M glicerol e -7°C, para soluções a 1,5M; 2) as amostras devem ser equilibradas à temperatura do ?seeding? por 5 a 10 minutos; 3) deve ser realizado o ?seeding?; 4) a temperatura do ?seeding? deve ser mantida por mais 10 minutos, para permitir equilíbrio da solução, inicialmente cristalizada; 5) as taxas de resfriamento devem estar entre -0,3 a -0,5°C por minuto até atingir temperaturas entre -30 a -40°C. É aconselhado manter as amostras no equipamento de congelação por 15 a 30 minutos antes de imergi-las em nitrogênio líquido (-196ºC), quando adotadas elevadas taxas de resfriamento.

Com a introdução da sacarose nos procedimentos de diluição de substâncias crioprotetoras intracelulares, as técnicas tornaram-se mais rápidas e seguras, pois a sacarose atua como um tampão osmótico, mantendo constante a concentração do meio extracelular, regulando a velocidade de entrada da água e saída do crioprotetor do embrião, evitando o choque osmótico. Somente após o emprego da sacarose e das palhetas francesas foi possível realizar o método ?one-step? de descongelação (Niemann, 1991). Este método permite a transferência direta dos embriões para as receptoras na mesma palheta no qual foram congelados. Isto simplificou significativamente a técnica, reduzindo o tempo requerido para preparar os embriões para serem transferidos e eliminando a necessidade de equipamentos especiais (Palasz e Mapletoft, 1996).

As taxas de sobrevivência após a descongelação apresentam variações segundo a qualidade pré-congelação de embriões bovinos. Os autores afirmam que elevados índices de sobrevivência somente são possíveis selecionando-se rigorosamente, através da morfologia, os embriões para congelação (Kennedy, 1986).

4.2 Vitrificação

A vitrificação é um protocolo de criopreservação baseado na desidratação do embrião ou ovócito através da sua breve exposição à soluções com alta concentração de crioprotetor seguida da imersão direta em nitrogênio líquido. Devido à alta concentração de crioprotetor e à rápida curva de congelação o sistema solidifica-se sem que ocorra cristalização (Martino et al., 1996b).

Na reprodução assistida a vitrificação é uma técnica promissora, sendo um procedimento simples, menos oneroso e que requer menos tempo do que os métodos de congelação (Dobrinsky, 2002; Kuleshova e Lopata, 2002).

Comparando-se as duas técnicas, a congelação tradicional é uma tentativa de manutenção do equilíbrio entre danos osmóticos e tóxicos utilizando baixas concentrações de crioprotetores e controlando a formação de gelo através da congelação do meio extracelular e desidratação do embrião. Em contraste, a estratégia de vitrificação é mais radical, pois é baseada na eliminação total da formação de gelo. Porém, as altas concentrações de crioprotetores aumentam os danos osmóticos e tóxicos. Por outro lado, a alta velocidade de resfriamento e aquecimento resulta em uma rápida passagem através da temperatura perigosa ao redor de 0ºC, o que minimiza os danos causados pelo resfriamento que prejudica predominantemente estruturas ricas em lipídeos (Vajta, 1997).

As soluções de vitrificação, assim como as soluções usadas para a congelação lenta, contêm um crioprotetor, vários sais e usualmente uma ou mais macromoléculas (O?Neil et al., 1997). Para protocolos de vitrificação, o EG em associação com outros crioprotetores não permeáveis tem se tornado a solução mais comumente utilizada (Hochi et al., 1996; Martino et al., 1996a e b).

4.2.1. Técnica convencional de envasamento em palhetas de 0,25ml

Esse método de vitrificação utiliza palhetas francesas de inseminação de 0,25ml. Contudo, essas palhetas limitam o padrão máximo de congelação e aquecimento a 2000ºC/min (Vajta et al., 1998).

4.2.2. Método OPS ? Open Pulled Straw

A técnica chamada de Open Pulled Straw (OPS) foi desenvolvida por Vajta et al. (1997), originalmente desenvolvida para embriões de bovinos e de porcos, e, com sucesso, modificada para a vitrificação de ovócitos bovinos.

Nesta técnica, as palhetas francesas de inseminação de 0,25ml são esticadas e cortadas ao meio, produzindo duas OPS. O envasamento é realizado por efeito capilar simples. Cerca de 1 a 2ml do meio de vitrificação contendo os ovócitos ou embriões é introduzido na extremidade estreita da palheta, a qual é imediatamente submersa no nitrogênio líquido. A coluna líquida solidifica-se imediatamente, sem que haja a dispersão da solução, o que é comum se forem utilizadas palhetas de tamanho original (Vajta et al., 1998). Neste método a taxa de resfriamento é de 20.000ºC/min (Kuleshova e Lopata, 2002).

O aquecimento é realizado pela colocação da ponta aberta diretamente na placa contendo o meio aquecido. O meio vitrificado volta ao estado líquido dentro de 1 a 2 segundos. Imediatamente após, os ovócitos ou embriões flutuam no meio de aquecimento (Vajta et al., 1998).

São descritas taxas de até 25% de produção de blastocistos a partir de ovócitos vitrificados (Cetin e Bastan, 2006).

É difícil determinar se a curva lenta de congelação, com as possíveis injúrias causadas pela cristalização ou a vitrificação, com os possíveis danos tóxicos e osmóticos seria a técnica mais apropriada para criopreservação de ovócitos bovinos (Hamano e Kuwayama, 1992).

Baseado no trabalho rápido, simples, seguro e de baixo custo e os padrões de sobrevivência e desenvolvimento descritos, a técnica OPS é considerada também no presente estágio como um considerável avanço na criobiologia reprodutiva, como um alto potencial de impacto nas futuras pesquisas e aplicação comercial de produção in vitro de embriões bovinos (Vajta et al., 1997).

5. CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES PRODUZIDOS in vitro E EMBRIÕES MICROMANIPULADOS

Muitas pesquisas têm sido realizadas para a criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro, pois estes são mais sensíveis à criopreservação e tem as taxas de gestação significativamente menores após a transferência quando comparado com os embriões produzidos in vivo também criopreservados (Dobrinsky, 2002).

Nos últimos anos, várias tentativas têm sido feitas para aumentar as taxas de sobrevivência desses embriões após a criopreservação. Duas linhas de pesquisa têm sido seguidas: a) modificações nos sistemas de cultivo in vitro para melhorar o meio embrionário para que os embriões possam resistir melhor às condições do processo de criopreservação; b) desenvolvimento de uma técnica de criopreservação específica adaptada para embriões produzidos in vitro (Martínez et al., 2002).

Há indicações de que o sistema de cultura e a composição do meio podem afetar a qualidade do embrião. Vários estudos têm mostrado que a qualidade do ovócito é o maior fator que determina a produção de blastocisto, o ambiente de cultura in vitro ao qual os embriões são expostos após a fertilização é a chave determinante da qualidade do blastocisto. Portanto, a habilidade dos embriões produzidos in vitro em sobreviver à criopreservação depende de sua qualidade, a qual pode ser afetada pelas condições de cultura (Pereira et al., 2005).

Embriões bovinos produzidos in vitro possuem maior conteúdo lipídico. Embriões cultivados in vitro na ausência de SFB são mais criotolerantes que aqueles cultivados em meio contendo soro. A redução do conteúdo lipídico citoplasmático dos embriões com fenazina etosulfato (PES), um composto que oxida NADPH, promove criotolerância aos embriões bovinos cultivados na ausência de soro (Seidel Jr., 2006).

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O grau de aproveitamento dos ovócitos e embriões criopreservados e descongelados depende de técnicas de tratamento que não produzam danos que os inviabilizem. Verifica-se, no entanto, que quando o manejo requer que os embriões bovinos sejam criopreservados antes da transferência para as receptoras, as técnicas correntes de criopreservação sempre causam perdas de viabilidade.

É necessário que sejam desenvolvidos protocolos específicos que resultem em boa preservação de óvócitos e embriões, os quais possam minimizar os danos causados aos mesmos em decorrência do processo de criopreservação e, conseqüentemente, maximizar a sua viabilidade pós-aquecimento.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALBARRACÍN, J.L.; MORATÓ, R.; ROJAS, C.; MOGAS, T. Effects of vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured prepubertal and adult bovine oocytes. Theriogenology, v.63, p.890-901, 2005.

ARNOLD, K., PRATSCH, L., GAWRIS, H K. Effect of poly (ethylene glycol) in phospholipid hydration and polarity of the external phase. Biochem Biophys Acta, v.782, p.121-128, 1983.

CETIN, Y.; BASTAN, A. Cryopreservation of immature bovine oocytes by vitrification on straws. Anim. Reprod. Sci., v.92, p.29-36, 2006.

DIDION, B.A.; POMP, D.; MARTIN, M.J.; HOMANICS, G.E.; MARKERT, C.L. Observation on the cooling and cryopreservation of pig oocytes at the germinal vesicle stage. J. Anim. Sci., v.68, p.2803-2810, 1990.

DIEZ, C.; DUQUE, P.; GÓMEZ, E.; HIDALGO, C.; TAMARGO, C.; RODRÍGUEZ, A.; FERNÁNDEZ, L.; VARGA, S.; FERNÁNDEZ, A.; FACAL, N.; CARBAJO, M. Bovine oocyte vitrification before or after meiotic arrest: effects on ultrastructure and developmental ability. Theriogenology, v.64, p.317-333, 2005.

DOBRINSKY J.R. Advancements in cryopreservation of domestic animal embryos. Theriogenology, v.57, p.285-302, 2002.

FAHY, G.M. The relevance of cryoprotectant ?toxicity? to cryobiology. Cryobiology, v.23, p.1-13, 1986.

FUKUI, Y.; LEE, E.S.; ARAKI, N. Effect of medium renewal during culture in two different culture systems on developmental to blastocysts from in vitro produced early bovine embryos. J. Anim. Sci., v.74, p.2752-2758, 1995.

GEORGE, M.A., XIA, L., DOWNEY, B.R. Ultrastructural changes in bovine oocytes cryopreserved by vitrification. Cryobiology, v.32, p.139-156, 1995.

HAMANO, S.; KUWAYAMA, M. Development of in vitro matured bovine oocytes after cryopreservation by vitrification and in vitro fertilization. In: INTERNATIONAL CONGRESS OF ANIMAL REPRODUCTION, 1992, The Hague. Proceedings? The Hague, 1992. p.1421-1423.

HOCHI, S., KOZAWA, M., FUJIMOTO, T., HONDO, E., YAMADA, J., OGURI, N. In vitro maturation and transmission electron microscope observation of horse oocytes after vitrification. Cryobiology, v.33, p.300-310, 1996.

IM, K.S., KANG, J.K., KIM, H.S. Effects of cumullus cells, different cryoprotectants, various maturation stages and pre-incubation before insemination on development capacity of frozen-thawed bovine oocytes. Theriogenology, v.47, p.881-891, 1997.

ISACHENKO, V., SOLER, C., ISACHENKO, E., SANCHES, F.P., GRISHCHENKO, V. Vitrification of immature porcine oocytes effects of lipd droplets, temperature, cytoskeleton and addition and removel of cryoprotectant. Cryobiology, v.36, p.250-253, 1998.

KENNEDY G.L. Jr. Biological effects of acetamide, formamide, and their monomethyl and dimethyl derivatives. CRC Crit. Rev. Toxicol.., v.9, p.129-182, 1986.

KULESHOVA L.L., LOPATA A. Vitrification can be more favorable than slow cooling. Fertil. Steril., v.78, p.449-454, 2002.

LANDIM-ALVARENGA F.C. Avaliação dos efeitos do congelamento e descongelamento sobre a viabilidade e morfologia de embriões equinos. 1995. 95p. Tese (Doutorado) ? Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, São Paulo.

MARTÍNEZ A.G., VALCÁRCEL A., de las HERAS M.A., MATOS D.G., FURNUS C., BROGLIATTI G. Vitrification of in vitro produced bovine embryos: in vitro and in vivo evaluations. Anim. Reprod. Sci., v.73, p.11-21, 2002.

MARTINO, A., POLLARD, J.W., LEIBO, S.P. Effect of chilling bovine oocytes on their developmental competence. Mol Reprod Dev, v.45, p.503-512, 1996a.

MARTINO, A., SONGSASEN, N., LEIBO, S.P. Development into blastocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Biology of Reproduction, v.54, p.1059-1069, 1996b.

MEN, H.; MONSON, R.L.; RUTLEDGE, J.J. Detection of DNA damage in bovine metaphase II oocytes caused by cryopreservation. In: ANNUAL CONFERENCE INTERNATIONAL EMBRYO TRANSFER SOCIETY, 2002, Foz do Iguassu. Proceedings… Foz do Iguassu, 2002. p.471.

NIEMANN, H. Cryopreservation of ova and embryos from livestock: current status and research needs. Theriogenology, v.35, p.109-124, 1991.

O?NEIL, L., PAYNTER, S., FULLER, B., SHAW, R. Vitrification of mature mouse oocytes: improved results following addition of polyethylene glycol to a dimethyl sulfoxide solution. Cryobiology, v.34, p.295-301, 1997.

PALASZ A.T., MAPLETOFT R.J. Cryopreservation of mammalian embryos and oocytes: recent advances. Biotechnology Advances, v.14, p.127-149, 1996.

PEREIRA, D.C.; DODE, M.A.N.; RUMPF, R. Evaluation of different culture systems on the in vitro production of bovine embryos. Theriogenology, v.63, p.1131-1141, 2005.

SCHNEIDER V., MAZUR P. Osmotic consequences of cryoprotectant permeability and its relation to the survival of frozen-thawed embryos. Theriogenology, v.21, p.68-79, 1984.

SEIDEL Jr., E.G. Principles of cryopreservation of mammalian embryos. Techniques for freezing mammalian embryos. Short course proceedings. Presented by Animal Reproduction Laboratory, Colorado State university, Fort Collins, Colorado, USA: 6, 1986.

SEIDEL JR., G.E. Modifyong oocytes and embryos to improve their cryopreservation. Theriogenology, v.65, p.228-235, 2006.

VAJTA G. Vitrification of bovine oocytes and embryos. Embryo Transfer Newsletter, v.15, p.12-18, 1997.

VAJTA, G., BOOTH, P.J., HOLM, P., GREVE, T., CALLESEN, H. Successful vitrification of early stage bovine in vitro produced embryos with the open pulled straw (OPS) method. Cryo-letters, v.18, p.191-195, 1997.

VAJTA, G., HOLM, P., KUWAYAMA, M., BOOTH, P.J., JACOBSEN, H., GREVE, T., CALLESEN, H. Open Pulled Straw (OPS): A new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Mol Reprod and Devel, v.51, p.53-58, 1998.

VOEKEL, A., HU, Y.X. Direct transfer of frozen thawed bovine embryos. Theriogenology, v.37, p.23-37, 1992.

WHITTINGHAM, D.G. Survival of mouse embryos after freezing and thawing. Nature, v.233, p.125-126, 1971.

WHITTINGHAM D.G. Principles of embryo preservation. In: ASHWOOD-SMITH M.J., FARRANT J. (Eds). Low temperature in medicine and biology, Tumbridege Wells:Pitman Medical, 1980. p.65-83.

YOUNG, E., KENNY, A., PUIGDOMENECH, E., VAN THILLO, G., TIVERON, G., PIAZZA, A. Human oocyte cryopreservation and pregnancy. Fertil Steril Suppl, 70:S16, 1998.

Site: http://www.bioembryo.com.br/noticias.php?cat=1&subcat=2&id=188

-

-

-